Elektroforéza DNA

Elektroforéza DNA

Horizontální agarosová elektroforéza

  • pracujeme v rukavicích, protože všechny věci mohou být kontaminovány SyberGreenem (potencionální mutagen!)
  • do Erlenmeyerovy baňky na předvážkách navážíme příslušné množství agarosy (nejčastější navážky viz tabulka)
% gel agarosa [g]
0.7 0,21 0,35 0,42 0,84 1,4
0,8 0,24 0,4 0,48 0,96 1,6
1,0 0,3 0,5 0,6 1,2 2
1,5 0,45 0,75 0,9 1,8 3
1,8 0,54 0,9 1,08 2,16 3,6
3,0 0,9 1,5 1,8 3,6 6
1× TBE [ml] 30 50 60 120 200
  • přidáme příslušné množství 1×TBE pufru (odměříme odměrným válcem), lehce kroužením promícháme
  • vložíme na několik minut do mikrovlnky na 550-700W; v uvařeném gelu nesmí být viditelné krystalky („nitky“) agarosy
  • mezitím si připravíme vaničku na nalití gelu – položíme ji na nalévací stolek (vodováhy v rozích)
  • podle počtu nanášených vzorků vybereme hřeben s dostatečným počtem zubů a umístíme ho do zářezů ve vaně
  • uvařený gel ochladíme kroužením „Erlenkou“ pod tekoucí vodou (používáme rukavici, abychom se nespálili) na teplotu cca 50°C (odhadneme tak, že udržíme ruku na dně baňky)
  • gel pomalu naléváme do vaničky s hřebínky, špičkou odstraníme případné bublinky v gelu a necháme tuhnout cca 30 minut
  • po ztuhnutí opatrně vyjmeme hřebínky, vaničku s gelem vložíme do elektroforetické vany a zalijeme pufrem (1×TBE) tak, aby celý gel byl těsně pod hladinou a všechny jamky byly zality
  • krajní jamky necháváme prázdné, do druhé jamky pipetujeme cca 6 µl 100bp Ladderu (žebříčku) a do dalších jamek pak směs DNA s nanášecím pufrem LB (Loading Buffer)
  • po nanesení všech vzorků na gel přiklopíme víko s přívodními kabely, připojíme elektroforézu ke zdroji; napětí nastavíme v modu „SET“ na 50 – 100 V (dle velikosti gelu) otáčením knoflíku
  • pro spuštění elektroforézy vypneme mod „SET“; po vyjetí vzorků z jamek napětí zvýšíme
  • ve chvíli, kdy čelo (nejrychlejší barvička) dojíždí ke konci gelu, vypneme proud, sejmeme víko elektroforetické aparatury, vyndáme gel a umístíme do komory UV transiluminátoru dokumentačního systému Gel Imager

Vertikální polyakrylamidová elektroforéza na 6,2% kontinuálním gelu

  • Pozor, akrylamid je toxický!

Obecné

  • Viz protokol na isozymy.

Postup

  • Do 1,5 ml eppendorfky připravíme 10% roztok APS (ammonium persulfate).
APS 0,022 g 0,033 g 0,056 g
destilovaná voda 200 µl 300 µl 500 µl
  • Do vysoké 250 ml kádinky připravíme následující směs:
1 gel 2 gely 4 gely
Mili-Q voda 19,85 ml 39,7 ml 59,55 ml
akrylamid (40%) + BIS (1 %) 3,9 ml 7,8 ml 11,7 ml
20× TBE pufr 1,25 ml 2,5 ml 3,75 ml
  • Opatrně, ale důkladně promícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci). V digestoři přidáme iniciátor (APS) a katalyzátor (TEMED) polymerace.
1 gel 2 gely 4 gely
10% APS 120 µl 240 µl 480 µl
TEMED 20 µl 40 µl 80 µl
  • Opatrně promícháme a ihned naléváme gel, zastrčíme hřebeny mezi skla.
  • Necháme gel 2–3 hodiny polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu!
  • Po ztuhnutí gelu vypláchneme jamky 1× TBE pufrem, naneseme vzorky a 100bp ladder.
  • Do horní i spodní elektroforetické vany nalijeme 1× TBE pufr.
  • Aparaturu není nutné chladit.
  • Elektroforézu spustíme na konstantní napětí 50 V, po vyjetí vzorků z jamek (cca 20 min.) zvýšíme napětí na 150 V. Elektroforéza trvá cca 3 hodiny.
  • Po skončení elektroforézy od sebe oddělíme skla. Gel ze skla nezvedáme prsty, ale opatrně nadzvedneme špachtlí nebo nožem jeden roh a střičkou stříkáme pod gel destilovanou vodu, dokud se gel od skla zcela neodlepí (sklo držíme rovně, aby gel po odlepení nesklouznul). Pracujeme nad miskou, do které odtéká přebytečná voda. Odlepený gel necháme opatrně sklouznout na navlhčenou plochu UV transluminátoru a vyfotíme.

Práce s dokumentačním systémem Gel Imager a softwarem Scion VisiCapture

  • Při manipulaci s gelem, nalévací vaničkou a elektroforetickou vanou pracujeme v rukavicích!
  • Po skončení elektroforézy vypneme zdroj a odpojíme od něj kabely.
  • Vyjmeme vaničku s gelem z elektroforetické vany.
  • Do komory fotodokumentačního zařízení umístíme již samotný gel a otočíme ho o 90° (horní jamky jsou blíž levé straně komory transluminátoru), opatrným posouváním po ploše se zbavíme případných vzduchových bublin pod gelem, gel srovnáme.
  • Bez rukavic (!) spustíme program Scion VisiCapture.
  • Klikneme na „Image“ a vybereme „Start Live Capturing“.
  • Při otevřených dvířkách komory si gel připravíme k focení, přímo na objektivu kamery můžeme vyladit zoom (velikost gelu nebo jeho části) a clonu (jas).
  • Zavřeme dvířka a zapneme UV světlo, popřípadě ještě doladíme obraz (expozici lze vyladit kliknutím na „Image“ a „Properties“ – nastavením délky expozice nebo elektronického zesílení signálu, tj. gain).
  • Klikneme na „Image“ a gel vyfotíme tlačítkem „Snap“.
  • Obrázek uložíme vybráním „File“ a „Save As“ do příslušné složky .
  • Vypneme zdroj UV světla, otevřeme dvířka, gel v rukavicích (!) zabalíme do papírového ručníku a vyhodíme do odpadkového koše k tomu určeného a očistíme plochu UV transiluminátoru ethanolem.

DNA žebříčky (ladders) používané v laboratoři (NEB)

DNA žebříčky
DNA žebříčky

DNA žebříčky
DNA žebříčky